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犬种精液液氮罐冷冻技术的发展及研究

     犬人工授精(artificial insemination, AI)技术是一种代替犬自然交配的繁殖技术,是在人工辅助下,采集种犬精液、经过品质检测和稀释保存等处理,再将精液输送到母犬生殖道内,使母犬受孕的配种技术。精液冷冻(semen cryopreservation)技术是指将采集到的新鲜精液,经过特殊处理后,利用液氮(—196℃)、干冰(—79℃)或其他冷源,以冻结形式长期保存精液的技术。目前在世界许多发达国家,犬的AI与精液冷冻研究已经得到广泛开展,并运用于实际生产中,而在国内也有人进行过研究;影响犬冻精人工授精成败的因素众多,本文主要从精液采集、评估、稀释、保存(包括冷藏保存、冷冻保存,以及解冻)和输精等方面对国内外犬的AI与精液冷冻研究进行综述,便于为以后国内相关研究提供参考。

 

犬作为宠物、警用、肉用和医学研究动物模型等的需求,在国内外已经发展成为重要的产业,同时关于犬的AI及精液冷冻技术的研究也在全世界范围内得到迅速发展。1780年,意大利生理学家Spallanzani第一次使用鲜精AI成功,1969年,Seager等首次用冻精AI获得成功。精液冷冻保存是人工受精的一项重大技术突破,它解决了精液的长期保存问题,使精液保存不受时间、地域和种畜寿命的限制,极大限度地提高了优良公畜的利用率,加速了品种的育成和改良步伐[1]。目前在世界上一些发达国家,犬的AI与冷冻精液研究已经得到广泛开展,并运用于实际生产中,最高受胎率达92%(Seager等,1975),而且幼犬的死亡率、畸形率、初生重及性别比例与自然交配相似。美国养犬俱乐部(American Kennel Club,AKC)在20世纪70年代即花费大量的资金用于犬的冷冻精液和AI研究,并详细制定了冷冻精液生产及AI各主要环节的操作规程;同时规定从1981年起,只有经过审验合格的配种站才有资格提供犬的冷冻精液。在国内,禹学礼等对豫西土狗的冷冻精液和AI试验获得成功,受胎率最高可以达到571%,平均窝产仔3[2]。由于我国犬AI与冷冻精液的研究尚处于试验阶段,所以有很多研究工作有待进行。

 

与犬自然交配方式相比,犬人工授精和精液冷冻技术有如下优越性:

1.                减少种公犬的数量,又能充分发挥优秀个体的遗传特性;做到提高经济效益的同时,又能加快优良犬种的培育。

2.                克服因体形差距过大、生殖道异常等原因而造成的交配困难。

3.                能够使配种不受地域和时间的限制。

4.                通过实施有效的AI操作流程,可以控制疾病传播,提高母犬的受胎率。

5.                建立精液基因库,实现品种资源保护。

 

 

1. 精液采集(semen collection)

采精的原则是保证公犬正常、充分的性欲和性行为表现,使射精顺利而完全,精液不被污染。认真做好采精前的准备,正确掌握采精技术,合理安排采精频率,是保证采得大量优质精液的前提。

1.1      采精前的准备

1.1.1       采精场地的准备  要求宽敞、平坦、安静、清洁、专用固定,便于公犬形成稳定的条件反射,也能保证人犬安全与防止精液污染。

1.1.2       器械的消毒与准备  不同的采精方法,需要准备相应的器械,但采精之前都要求对相应的器械、用具进行清洗、消毒。

1.1.3       台犬的准备  目前多采用发情的母犬作为台犬,发情母犬的气味可以提高公犬的性欲,刺激射精。采精前台犬的后躯、尾根部、外阴部、肛门部位,都应彻底洗涤清洁,再用消毒过的干抹布擦干。也可采集正常母犬发情期的阴道分泌物,置于海绵中,—20℃冷冻保存备用(这些激素也有商品出售,如对羟基苯甲酸甲酯)。采精时,可用对精子无毒的润滑剂涂抹龟头球,防止采精后包皮后翻。

1.1.4       种公犬的准备和调教  公犬采精前的准备包括体表的清洁消毒和诱情,公犬的调教因品种性格、体格大小、营养状况等不同,效果也有差异。对于胆怯、性欲差的公犬,需要较长时间耐心地调教。

 

1.2      采精方法 

1.2.1       按摩法  按摩采精法是国内外普遍采用的一种方法,其最大的优点是简单易行,并且易将射精的三阶段分开。操作人员右手戴上乳胶手套,轻缓地将公犬阴茎推出包皮,握住阴茎球给予适当的压力,公犬的阴茎便会充分勃起,经按摩1min左右即可射精。左手拿集精容器准备收集精液。

 

公犬为分段射精,在射精间隙更换集精容器,分段收集精液。犬的射精量为2ml15ml,分三部分排出。第一部分是由尿道球腺分泌的水样液体,呈滴状,无精子;第二部分来自睾丸,富含有精子,呈云雾状白色粘滑液体;最后部分是前列腺分泌物,比较清亮,量多但不含精子。故主要收集第二部分精液。

阴茎完全勃起后,公犬表现为抬起一只后腿企图越过采精者的手臂,在自然交配过程中也会发生抬后腿现象,越过母犬背部将身体转向相反方向,使勃起的阴茎向后旋转180°。阴茎的扭转能引起龟头静脉的闭塞,可阻止阴茎增大的消退。该部位阴茎弹性很大,扭转不会引起公犬的不适(Grandage1972)。犬的阴茎骨能阻止阴茎在勃起和扭转过程中尿生殖道的闭塞。

在收集精液时,要特别注意器具不能触及龟头,否则会造成射精停止。另外,采精手应在龟头的背部必须保持一定的压力。犬精子对冷休克敏感性低,但易受热休克的刺激,应防止温度的突然变化,可置于体温(37℃)和室温(20℃)之间保存。

 

1.2.2       假阴道法  该方法是利用模拟母犬阴道环境制造的人工阴道,诱导公犬在其中射精而收集精液的方法。应用假阴道法采精的三个主要条件是假阴道的温度、压力和润滑度。有报道称,假阴道的橡胶材料容易对精子的活性质量产生影响。

1.2.3       电刺激法  是利用电刺激采精器,通过电流刺激有关神经和壶腹部,而引起公犬射精的方法。

 

1.3      采精频率  是指每周对公犬采精的次数,要根据正常生理状况下睾丸一定时期内产生的精子数、附睾的储精量、每次射精量、饲养管理水平等因素确定。公犬适宜的采精频度应该是1周采精23次,或隔日采精一次。

 

2. 精液评估semen quality measurement 

鲜精及解冻后的精子都需要进行品质检查,鲜精评价的主要目的是估计公犬的睾丸和附睾功能是否正常,而冻精评价则主要是确定精子细胞在冷冻解冻过程中的损伤程度,评估的最终目的是预测精子的受精能力。

精液品质检查通常分为原精和冻精品质检查,原精品质检查的内容主要包括精液量、精子密度、精子活率和活力、精液颜色、精液气味、精液PH值、精子形态学检查、细菌学检查等指标;冻精品质检查的主要内容包括精子活率和活力、形态、质膜完整性、细菌学检查等指标。在众多评估项目中,精子密度、精子活力和精子形态是最常用的三个指标。

评定精液质量的方法,大致可以归纳为四种:一是外观检查;二是显微镜检查;三是生物化学检查;四是存活力测定。采用多项检查方法,能全面地确定精液的品质。随着研究的深入,更细致多样的方法被应用,包括荧光染色技术、计算机辅助精子检测、流式细胞技术、透明带结合法、卵母细胞结合法等,而最有说服力的检测方法就是人工授精后母犬的受孕率及产仔率。

 

2.1 外观评定  通过肉眼观察,对精液品质做出初步估测。

2.1.1  精液量  犬精液量因品种、个体存在差异,同一个体又可因年龄、健康程度、采精方式及技术水平、采精频率和营养状况而有所变化。将所采集到的精液倒入高精度的刻度离心管进行读数,一般种公犬富含精子部分(第二部分精液)的精液量为O55ml

2.1.2  精液颜色  犬的正常精液颜色,一般为乳白色,有时也呈乳黄色(通常在公犬采精间隔时间很久的情况下发生)。 如果精液颜色异常,表明公犬生殖器官可能有疾病。精液呈乳清样说明精子稀少,提示睾丸发育不良或附睾炎、隐睾等;精液带有浅绿色,可能混有脓液;呈黄色, 则可能混有尿液;若带有淡红色,提示生殖道可能有出血;若含有块状物或絮状物,表明生殖道可能有炎症,特别是精囊腺有炎性渗出物。

2.1.3  精液气味  公犬正常精液略带腥味。如带有其他的异常气味,则可能混有脓液、尿液、灰尘等异物,常伴有色泽的改变,应废弃。

 

2.2       显微镜检查  

2.2.1             精子活力(sperm motility  精子活力是指精液中呈直线前进运动的精子数占总精子数的百分率。而精子活率是指精液中能够活动的精子所占的百分率,精液中,活的精子除了直线前进运动外, 还以漩涡式运动、原地摆动等形式存在,所以,精子活率≥精子活力。因为只有直线前进的精子才可能具有受精能力,所以精子活力与母犬受胎率密切相关,这部分 精子越多母犬的受胎率就越高。

评定精子活力常用十级评分法,即视野中100%的精子呈直线前进时评为1O分;90%的精子呈直线前进时定为09分,其他的依此类推。一般新鲜精液的精子活力在0.7分以上。

精子活力检查方法有多种,比较常用的三种方法是:目测评定法、计算机辅助精液分析和死活精子计数法。

 

目测评定法:利用普通显微镜或相差显微镜,在37℃条件下,放大200400倍,对精液样品进行目测评定。如果样品精子浓度很高,可用温的生理盐水或Tris-果糖稀释后再检查(Rigau等,2001)。用显微镜估计活精子的数量简便快速,但主观性很强,而且难以预测精子的生育力(Linford等,1976)。

 

计算机辅助精液分析(computer assisted semen analysis, CASA: 利用转换镜头和数据线,将显微镜视野接入计算机并显示在屏幕上,再根据特定的软件对视野内的精子进行统计分析。常用血球计数板代替普通载玻片,盖上盖玻片后,使精液形成100微米厚度的均匀液面,被测样本形成一个精子层。

 

死活精子计数法  利用活精子对特定染料不着色而死精子着色的特点来区分活精子和死精子。最简单的染色法可采用单纯的5%伊红或1.11.5%红 汞溶液作为染色剂。但此法只可用作对原精液检查,而不适用于冷冻精液,这是由于甘油能使精子细胞膜渗透性增强,可造成着色精子数异常增多。此外,还可以采 用升温法检查死活精子的比例:把适当倍数稀释后的精液样品置于血细胞计数板上,在恒温显微镜下首先统计出死亡的精子数,然后加热(100℃恒温干燥箱内,2min)以使精子全部死亡,再计算精子总数,便可算出死活精子的百分率。

 

2.2.2           精子密度(sperm concentration)  指每毫升精液中所含精子数。通常公犬每毫升精液中精子数为1.250.45.4)亿。目前测定犬精子密度的主要方法有血球计数板计数法、光电比色计测定法和电子颗粒计数仪测定法。

 

血球计数板计数法  该法计算精子数与计算血液中的红细胞和白细胞数的方法相似。此法需要设备比较简单,但操作步骤多,较费时。其主要操作步骤是:用3%氯化钠溶液将一定量(取样通常是10微升)精液稀释100倍,然后使用显微镜和血球计数板计算稀释精液中的精子数,最后根据计数板原理(血球计数板的计数室深0.1mm,底部为正方形,边长是1.0mm;底部正方形又划分成25个小方格,每个小方格又是由16个小正方形组成;计算室容积是0.1立方毫米)换算出精子密度。

lml原精液中的精子数=5个大方格内的精子数(即记数室中5个读数视野的精子总数)×5(等于整个计数室中25个大方格内的精子总数)×10(等于1立方毫米内的精子总数)×1000(等于lml被检测的稀释精液样品内的精子总数)×100 (被检测精液的稀释倍数)

使用计算机辅助精液分析系统(CASA)计算精液的精子浓度比较直观、方便,而且可以将被测精液的相关数据全部存入电脑,便于日后的需要。

 

光电比色计测定法  是根据精子数越多,透光性越差的特点,能准确测定精子浓度。此方法测定结果与使用血细胞计数器计数的测定结果近似,相关系数在0.93以上。精子密度测定仪是最新型的光电比色计,可快速、准确、方便地测定精子密度,已被冷冻精液生产单位普遍采用。

 

电子颗粒计数仪测定法  稀释的精液样品通过特制直径很小的毛细管时,每次只有一个精子细胞在两个电极之间通过,精子头部引起的电阻徒增被计数器记录。次方法准确度更高,但仪器价格昂贵。

 

2.2.3       精子形态  精子形态是否正常与受胎率密切相关,精子形态学检查通常分为精子的畸形率和顶体完整率两项内容,如果精液中含有大量畸形或顶体异常精子,受胎率就会降低。

精子畸形率(abnormal sperm rateASR  指精液中形态和结构不正常的精子占精子总数的百分率。正常精液中也有一定量的畸形精子,但不会超过20%,一般对受精力影响不大。根据精子不同的变态部位,精子畸形一般分为4种:头部畸形、颈部畸形、中段畸形和主段畸形。测定方法:将精液均匀涂抹在载玻片上,自然干燥后,用95%酒精度的3min,然后用普通染色液(如伊红、美蓝)或红、蓝墨水染色5min,水洗干燥后,400600倍显微镜下随即检查500个精子,可计算出畸形精子百分率。

精子顶体异常率(abnormal acrosome rate,AAR  正常精子顶体内含有多种与受精有关的酶类,一般认为只有直线前进并且顶体完整的精子才可具有正常的受精能力。正常精液中可能存在少量顶体异常的精子,如果精子顶体异常率过高,将直接导致受精力下降。测定方法:将精液制成抹片,自然干燥后,固定液中固定90min,经水洗风干后用姬姆萨染色90min,再水洗风干后于1000倍显微镜下随机观察500个精子,可计算出顶体异常率。采用电子显微镜观察精子顶体破损情况比光学显微镜要准确得多。

 

2.3       生物化学检查  通过对精清的生化分析判断精子的代谢能力和副性腺及其分泌物是否正常,在一定程度上反映精子的生化特性及其受精潜能。

2.3.1           精液pH检查  犬的精液pH值平均为6.46.17.0),pH值的高低与副性腺分泌物有关,第一部分精液pH 值居中、第二部分精液的 pH值最低;第三部分精液的 pH值最高。pH值偏低的品质较好,pH值偏高的精子活力、受精力都显著降低。

精子代谢很强烈,能量消耗快;同时代谢产物能改变精子环境的pH值,导致某些酶的活性被抑制,影响精子受精能力;国内外学者已对此作过专门研究,精液pH值可因精子代谢及其他原因而变化,当精液pH值降低时,精子代谢与活动减弱;反之,因pH值上升,精子代谢与活动增强,能量迅速耗竭,存活时间减少。为维持正常代谢活动,犬精子需要的适宜pH值范围是6470[3]。部分国外学者认为最佳pH值为66[4],国内部分学者在配制精液稀释液时未充分考虑pH值的变化,这是造成了精子冻后活力降低的重要因素;辛国省等(2007)通过对藏獒精液低温保存稀释液的pH值研究认为犬的精液低温保存稀释液的pH65时精子有较高活力[5]

测定方法:最简单方法是用pH试纸比色,目测即得结果,但结果误差大;比色计测定pH值结果更为准确。

 

2.3.2       精子代谢能力测定  精子自身所储存的能量有限,正常情况下,精子主要利用环境中单糖等外源性营养物质进行代谢而获得能量。精子代谢能力测定主要包含精子耗氧量测定和果糖代谢测定。

 

另外,测定精清中其他化合物,如乳酸、柠檬酸、甘油磷酸胆碱、精氨酸、肉毒碱、类固醇激素和前列腺素等,有助于全面了解精液的品质和动物的生育力。

 

2.4       其他检查

2.4.1       精子存活时间和存活指数测定  精子存活时间是指精子在一定外界条件下(保存温度、稀释液、稀释倍数等)总的生存时间;而存活指数是指精子的平均存活时间,反应精子活力下降的速度。精子存活时间越长、存活指数越大,说明精子生活力越强,精液品质越好,所用的稀释液越佳。

2.4.2       微生物检查  动物正常精液中不含任何微生物,但采精来的精液,往往含有一定数量的细菌。精液中微生物的来源与公犬生殖器官疾病和人工采精的卫生条件密切相关,因此有必要对精液(特别是进口冻精)进行细菌性检查。正常种公犬的鲜精每1ml所含的细菌数量一般不超过1000个,而冻精由于在制作及冷冻包装过程中细菌的感染的机会增多,一般每1ml所含的细菌数量控制在2500个内。

 

3. 精液稀释(Semen dilution) 

精液稀释的目的有:扩大精液容量,增加配种数量;降低精子能量消耗,补充营养和保护物质,抑制精液中有害微生物活动,延长精子存活时间,增强受精能力;便 于精液保存和运输。因此精液的稀释,是充分体现和发挥人工授精优越性的重要技术环节。目前最普遍使用的一种稀释液是以果糖.Tris-柠檬酸为基础,添加适量的卵黄和甘油。

3.1       稀释液的主要成分和作用   

3.1.1       营养物质  为精子提供营养,补充精子在代谢过程中消耗的能量。常被使用的此类物质有:葡萄糖、果糖、乳糖、卵黄、蜂蜜、奶粉、椰汁等,目前氨基酸、丙酮酸盐也成为稀释液研究的新方向。各种商品化的稀释液也陆续在市场上出现并得到人们的认可,如德国Tiefenbach基于TrisTriladyl,美国PennsylvaniaCLONE[6]

3.1.2       保护性物质  保护精子抵抗各种不良外界环境因素的伤害。

缓冲物质:用于保存精液适当的pH,利于精子存活。常用的有:三羟甲基氨基甲烷(Tris)、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、酒石酸钾钠、EDTA(乙二胺四乙酸)等。

防冷刺激物质:由于冷刺激,会使精子遭受冷休克而失去活力,特别是从20℃以上急剧降至0℃时。这是由于精子内的缩醛磷脂融点高,低温下容易凝结。常用的物质有:卵黄和奶类等,此类物质含有卵磷脂,卵磷脂融点低,不易冻结,进入精子体内能替代缩醛磷脂保障代谢的正常进行,同时卵磷脂能稳定精子细胞膜,防止顶体破裂。

抗冻保护剂:精液在冷冻过程中,精子内外环境的水分会形成冰晶,导致精子损伤和死亡;抗冻物质有助于减轻或消除这种危害。常用的抗冻剂有:甘油、乙二醇(EG)、丙二醇、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等。高雅等(2010)报道称,乙二醇与甘油作为保护剂的最佳浓度均为6%,但6%乙二醇对犬冷冻精液的活力高于6%甘油[7]

抗菌物质:精液稀释液中添加一定抗菌药,有利于抑制细菌的繁殖;细菌在精液中繁殖不仅影响精液品质,而且也会造成输精后母犬生殖道的感染,甚至引起子宫蓄 脓、败血症等严重威胁生命的疾病。在采精和精液处理过程中,难免使精液受到细菌的污染,而且精液及稀释液中含有丰富的、有利于细菌繁殖的营养物质,因此, 在精液稀释液中加入抗菌药是十分必要的。常用的抗菌物质有青霉素、链霉素、氨苯磺胺等。青霉素和链霉素混合使用更具有广谱的抑菌效果;氨苯磺胺不仅可以抑 制细菌微生物的繁殖,而且可以抑制精子的代谢机能,有利于延长精子在体外的存活时间,但它在冷冻过程中对精子反而有害,所以只适用于液体精液的保存;抗生 素技术发展很快,新抗生素不断发现与合成,而且作用机制十分复杂,在精液稀释液中的使用有待进一步研究和完善。

 

31.3  其他添加剂  还有一些添加剂能调节和改善精子外在环境,有利于提高受精机会,促进合子发育,常见的类别有:

酶类  如β-淀粉酶,能促进精子获能,提高受胎率。

激素类 OXTPGE等,能促进母犬生殖道蠕动,有利于精子运行,从而提高受胎率。

维生素类 B族维生素、维生素C、维生素E等,具有改善精子活力,提高受胎率的作用。

其他添加成分 ATP、咖啡因[8]、精氨酸等也能提供精子活力。

 

3.2  稀释方法  犬精液稀释有两种方法:一步稀释法和两步稀释法。一步稀释法是把含甘油的稀释液在室温下一次稀释完毕;二步稀释法是在室温下第一次添加无甘油稀释液,降温平衡后、冷冻前添加等温含甘油稀释液。二步稀释法使精子逐步适应高渗环境,解冻后的精子质量较好.A. Pena等研究发现先用含低浓度甘油(3%)稀释液稀释精子,再用含高浓度甘油(7%)稀释液等倍稀释后的精液在解冻后质量更佳[9]

 

4. 精液保存(semen preservation) 

精液保存是为了延长精子的存活时间,维持其受精能力提高公犬配种效能。精液保存方法分液态保存和冷冻保存两大类。

4.1      精液液态保存  指精液稀释后,在0℃以上,以液态形式作短期保存,通过两种基本途径实现:;一是控制精液的ph值,利用稀释液的弱酸环境或胶冻环境抑制精子的活动,降低精子能量消耗,使精子在常温(1525℃)下得以保存更长时间,这种方法是2天内短期保存精液的简单方法;二是降低保存温度(达到05℃),减少精子运动和代谢,甚至使精子处于休眠状态,但不丧失生命力这两种情况下保存的精子,一旦环境温度和ph值恢复正常,精子又将重新恢复原有的运动和代谢水平。

   

4.2      精液冷冻保存  是指将采集到的新鲜精液,经过特殊处理后,利用液氮(—196℃)、干冰(—79℃)或其他冷源,以冻结形式长期保持精液。精液冷冻保存是人工授精技术的一项重大革新,极大地提高优良公犬的利用率,加速品种的育成和改良。

精 液冷冻保存原理:精子在冷冻状态下,代谢几乎停止,生命以相对静止状态保存下来,一旦升温又能复苏恢复受精能力。从理论上讲,冷冻精液可以无限期得到有效 保存,但目前的冷冻解冻技术,只有部分精子能够正常复苏;这主要是由于在冷冻过程中,细胞内水的冰晶化对精子造成危害;冰晶化(crystallization)是指在一定降温过程中,水分子重新按几何图形排列形成冰晶(结晶体),冰晶只有在0-60℃温度范围内形成,降温或升温速度越慢,冰晶形成越大;-15-25℃时形成冰晶最多,故把此温区称为精子冷冻过程中的危险致死温区;冰晶先形成于精子外水分,造成精子外高渗溶液,使精子脱水损伤,同时精子内水分结晶后,体积增大和冰晶块移动,对精子产生机械损伤,也会造成精子死亡。

玻璃化(vitrification)是在超低温下,水分子保存原来无次序的排列,呈现均匀的冻结团块;精子在玻璃化冻结状态下,不会出现原生质脱水,结构受到保护,解冻后仍可恢复活力;在稀释液中添加甘油等亲水性物质,能减轻冰晶化,但甘油浓度过高对精子又毒害作用。

 

精液冷冻保存技术的一般步骤是:精液品质检查 → 精液稀释 → 降温与平衡 → 分装与冷冻 → 解冻与检查 → 保存与运输。

 

4.2.1 精液品质检查  精液品质直接影响冷冻后的效果。鲜精采精后应置于30℃左右的环境中,迅速准确地检查精液品质,作为冷冻精液用的原精液,精子活率应在0.8以上,并应选用公犬的第二段精液。

 

4.2.2 精液稀释  冷冻保存稀释液,一般是在原有低温保存稀释液的基础上,再添加一定的防冻物质。根据配制的要求和稀释的需要,可分别配制如下三种溶液,便于生产者使用:

基础液  将糖类、盐类等可经高温消毒的药品成分,成批量地配制成溶液,瓶装密封保存;

Ⅰ液  根据每次采精量,计算所需的稀释液量,在定量基础液中加入卵黄和抗生素等配制而成,用作精液的第一次稀释;

Ⅱ液  取需要量的Ⅰ液,按配方比例加入一定量的甘油配制而成,用作精液的第二次稀释。

目前精液冷冻保存应用最广泛的稀释液是卵黄-Tris稀释液(配方见下表),生产中多采用两次稀释法:首先用不含甘油的Ⅰ液对精液进行稀释,放置一定时间后加入Ⅱ液。放置时间的长短,以及此阶段是否降温,没有统一的说法。

 

卵黄-Tris稀释液的配方

 

 

成分

Tris

果糖

柠檬酸

卵黄

甘油

蒸馏水(加至)

抗生素

用量

2.422g

1.0g

1.36g

20ml

8ml

100ml

 

青、链霉素各10IU

 

4.2.3 降温和平衡  降温是从30℃经12小时缓慢降温至35℃,以防止低温对精子的打击。平衡是把稀释后的精液降温后,放置在35℃的环境中停留一定时间,是精子有一段适应低温的过程,同时使甘油充分渗入到精子内部,平衡时间通常以24小时为宜。

    张志平等(2010)报道称,选取0.5%果糖的卵黄-Tris稀释液,平衡120 min,然后熏蒸20 min设计精液在距液氮面20 cm处),可获得较高的犬精子冻后活力[10]

 

4.2.4 分装和冷冻  精液分装保存形式有三种,即细管型、颗粒型和安培型,应用最广泛的是细管型,管长125133 mm,0.25ml0.5ml两种剂型,目前大多采用0.25ml的微型细管,提高了精液的利用率。用塑料细管进行精液分装,然后用逐步降温法或一步降温法进行冷冻。冷冻速度可以通过控制从细管到液氮面的距离及冷冻时间得到控制。

张江等(2006)报道称,在Beagle犬精液冷冻研究中,冻管法效果略好于颗粒冷冻法,但是颗粒法与冻管法之间没有统计上的显著差异[11]

 

禹学礼等(2004)报道在含4%甘油的卵黄-Tris冷冻稀释液中,0.5ml犬细管精液的最佳冷冻程序是[12]

 

4

0

-80

-196

 

0.3/min

垂直降温

 

30/min

 

4.2.5 精液解冻  解冻过程应像冷冻过程一样,必须迅速通过精子的冰晶化温度区,减少对精子的损害;对0.5ml塑料细管精液来说,可在水浴70℃解冻6.5sAndersen1972)、70℃解冻8s(Farstad,1984)50℃解冻30sSilva等,1995)、30℃解冻30s(Gettlc,1982)37℃解冻2min55℃解冻5sDobrinski等,1993)。原则上,输精前解冻,解冻后精子活率不低于0.3,解冻后即输精。实验证明,解冻后即输精与解冻后4小时再输精,受胎率由77%降到51%

 

4.2.6 保存与运输  冻结的精液经抽检合格后,按品种、编号、采精日期、型号等标记包装后,转入液氮罐中贮存备用。为保证精液冷冻品质,在贮存和取用过程中必须注意以下事项:

     定期添加液氮,不得使冻精的提筒暴露于液氮外;

     从液氮罐取冻精时,提筒不得提出液氮罐外,可将提筒置于罐颈下部,用长镊子夹取细管;

     转移冻精时,动作要迅速,冻精脱离液氮时间不得超过10秒。

 

5.   输精(insemination  又称为授精,是把一定量精液输入发情母犬生殖道的操作技术。输精是保证母犬妊娠的关键步骤,操作前应做好各方面的准备,以确保输精工作的正常实施。

5.1 输精前准备 

5.1.1  母犬的准备  将发情母犬保定后,尾巴拉向一边,将阴门及附近用温肥皂水擦洗干净,并用消毒液进行消毒,而后再用生理盐水冲洗,之后擦干净。

5.1.2  输精器械的准备  犬的输精管可用尼龙软管、玻璃细管等自制的输精管,使用前高压灭菌彻底消毒,防止人为造成细菌感染。

5.1.3  精液的准备  输精用的精液要经过品质检查,确认合格后方可用于输精。

 

5.2      输精要求  输精量应根据母犬体型和精液品质确定,新鲜精液一般为1.510ml,有效精子数为0.62亿,活力在0.6以上,每次发情输精2次;冷冻精液输精量为0.250.5ml,1500万个精子,精子活力在0.5以上。

 

5.3      输精方法 

5.3.1              母犬的保定  助手帮忙固定母犬的头部,将保定好的母犬尾巴拉向一侧,用温水洗净母犬外阴部并擦干。

5.3.2              打开阴道  将阴道开膣器加温并涂上液体石蜡,插入阴道,借助光线将开膣器前端顶住子宫颈口,并向前下方推进,便于固定子宫颈。

5.3.3              注入精液  在输精管前端涂少量液体石蜡,通过阴道开膣器插入子宫颈,尽量插入到深处,然后推到注射器,将精液注入;精液注射完后,用注射器吸入1ml空气再注入,以顶出输精管内残留的精液。接着将输精管后退几厘米,并倒抽注射器,若没有吸到精液,就可以抽出输精管和阴道开膣器;若精液倒流回注射器内,应把精液全部抽出,重新调整开膣器位置,直到准确完成输精操作。

5.3.4              输精后的刺激  为防止精液的流失,输精后可将母犬后躯抬高几分钟,并用手指伸入阴道前庭内510min,按摩阴蒂引起生殖道收缩,促进精子向上运动。

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