犬人工授精(artificial insemination, AI)技术是一种代替犬自然交配的繁殖技术,是在人工辅助下,采集种犬精液、经过品质检测和稀释保存等处理,再将精液输送到母犬生殖道内,使母犬受孕的配种技术。精液冷冻(semen cryopreservation)技术是指将采集到的新鲜精液,经过特殊处理后,利用液氮(—196℃)、干冰(—79℃)或其他冷源,以冻结形式长期保存精液的技术。目前在世界许多发达国家,犬的AI与精液冷冻研究已经得到广泛开展,并运用于实际生产中,而在国内也有人进行过研究;影响犬冻精人工授精成败的因素众多,本文主要从精液采集、评估、稀释、保存(包括冷藏保存、冷冻保存,以及解冻)和输精等方面对国内外犬的AI与精液冷冻研究进行综述,便于为以后国内相关研究提供参考。
犬作为宠物、警用、肉用和医学研究动物模型等的需求,在国内外已经发展成为重要的产业,同时关于犬的AI及精液冷冻技术的研究也在全世界范围内得到迅速发展。1780年,意大利生理学家Spallanzani第一次使用鲜精AI成功,1969年,Seager等首次用冻精AI获得成功。精液冷冻保存是人工受精的一项重大技术突破,它解决了精液的长期保存问题,使精液保存不受时间、地域和种畜寿命的限制,极大限度地提高了优良公畜的利用率,加速了品种的育成和改良步伐[1]。目前在世界上一些发达国家,犬的AI与冷冻精液研究已经得到广泛开展,并运用于实际生产中,最高受胎率达92%(Seager等,1975),而且幼犬的死亡率、畸形率、初生重及性别比例与自然交配相似。美国养犬俱乐部(American Kennel Club,AKC)在20世纪70年代即花费大量的资金用于犬的冷冻精液和AI研究,并详细制定了冷冻精液生产及AI各主要环节的操作规程;同时规定从1981年起,只有经过审验合格的配种站才有资格提供犬的冷冻精液。在国内,禹学礼等对豫西土狗的冷冻精液和AI试验获得成功,受胎率最高可以达到57.1%,平均窝产仔3只[2]。由于我国犬AI与冷冻精液的研究尚处于试验阶段,所以有很多研究工作有待进行。
与犬自然交配方式相比,犬人工授精和精液冷冻技术有如下优越性:
1.
2.
3.
4.
5.
采精的原则是保证公犬正常、充分的性欲和性行为表现,使射精顺利而完全,精液不被污染。认真做好采精前的准备,正确掌握采精技术,合理安排采精频率,是保证采得大量优质精液的前提。
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.1.4
1.2
1.2.1
公犬为分段射精,在射精间隙更换集精容器,分段收集精液。犬的射精量为2ml~15ml,分三部分排出。第一部分是由尿道球腺分泌的水样液体,呈滴状,无精子;第二部分来自睾丸,富含有精子,呈云雾状白色粘滑液体;最后部分是前列腺分泌物,比较清亮,量多但不含精子。故主要收集第二部分精液。
阴茎完全勃起后,公犬表现为抬起一只后腿企图越过采精者的手臂,在自然交配过程中也会发生抬后腿现象,越过母犬背部将身体转向相反方向,使勃起的阴茎向后旋转180°。阴茎的扭转能引起龟头静脉的闭塞,可阻止阴茎增大的消退。该部位阴茎弹性很大,扭转不会引起公犬的不适(Grandage,1972)。犬的阴茎骨能阻止阴茎在勃起和扭转过程中尿生殖道的闭塞。
在收集精液时,要特别注意器具不能触及龟头,否则会造成射精停止。另外,采精手应在龟头的背部必须保持一定的压力。犬精子对冷休克敏感性低,但易受热休克的刺激,应防止温度的突然变化,可置于体温(37℃)和室温(20℃)之间保存。
1.2.2
1.2.3
1.3
2. 精液评估(semen quality measurement)
鲜精及解冻后的精子都需要进行品质检查,鲜精评价的主要目的是估计公犬的睾丸和附睾功能是否正常,而冻精评价则主要是确定精子细胞在冷冻解冻过程中的损伤程度,评估的最终目的是预测精子的受精能力。
精液品质检查通常分为原精和冻精品质检查,原精品质检查的内容主要包括精液量、精子密度、精子活率和活力、精液颜色、精液气味、精液PH值、精子形态学检查、细菌学检查等指标;冻精品质检查的主要内容包括精子活率和活力、形态、质膜完整性、细菌学检查等指标。在众多评估项目中,精子密度、精子活力和精子形态是最常用的三个指标。
评定精液质量的方法,大致可以归纳为四种:一是外观检查;二是显微镜检查;三是生物化学检查;四是存活力测定。采用多项检查方法,能全面地确定精液的品质。随着研究的深入,更细致多样的方法被应用,包括荧光染色技术、计算机辅助精子检测、流式细胞技术、透明带结合法、卵母细胞结合法等,而最有说服力的检测方法就是人工授精后母犬的受孕率及产仔率。
2.1 外观评定
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.2
2.2.1
评定精子活力常用十级评分法,即视野中100%的精子呈直线前进时评为1.O分;90%的精子呈直线前进时定为0.9分,其他的依此类推。一般新鲜精液的精子活力在0.7分以上。
精子活力检查方法有多种,比较常用的三种方法是:目测评定法、计算机辅助精液分析和死活精子计数法。
目测评定法:利用普通显微镜或相差显微镜,在37℃条件下,放大200~400倍,对精液样品进行目测评定。如果样品精子浓度很高,可用温的生理盐水或Tris-果糖稀释后再检查(Rigau等,2001)。用显微镜估计活精子的数量简便快速,但主观性很强,而且难以预测精子的生育力(Linford等,1976)。
计算机辅助精液分析(computer assisted semen analysis, CASA): 利用转换镜头和数据线,将显微镜视野接入计算机并显示在屏幕上,再根据特定的软件对视野内的精子进行统计分析。常用血球计数板代替普通载玻片,盖上盖玻片后,使精液形成100微米厚度的均匀液面,被测样本形成一个精子层。
死活精子计数法
2.2.2
血球计数板计数法
lml原精液中的精子数=5个大方格内的精子数(即记数室中5个读数视野的精子总数)×5(等于整个计数室中25个大方格内的精子总数)×10(等于1立方毫米内的精子总数)×1000(等于lml被检测的稀释精液样品内的精子总数)×100 (被检测精液的稀释倍数) 。
使用计算机辅助精液分析系统(CASA)计算精液的精子浓度比较直观、方便,而且可以将被测精液的相关数据全部存入电脑,便于日后的需要。
光电比色计测定法
电子颗粒计数仪测定法
2.2.3
精子畸形率(abnormal sperm rate,ASR)
精子顶体异常率(abnormal acrosome rate,AAR)
2.3
2.3.1
精子代谢很强烈,能量消耗快;同时代谢产物能改变精子环境的pH值,导致某些酶的活性被抑制,影响精子受精能力;国内外学者已对此作过专门研究,精液pH值可因精子代谢及其他原因而变化,当精液pH值降低时,精子代谢与活动减弱;反之,因pH值上升,精子代谢与活动增强,能量迅速耗竭,存活时间减少。为维持正常代谢活动,犬精子需要的适宜pH值范围是6.4~7.0[3]。部分国外学者认为最佳pH值为6.6[4],国内部分学者在配制精液稀释液时未充分考虑pH值的变化,这是造成了精子冻后活力降低的重要因素;辛国省等(2007年)通过对藏獒精液低温保存稀释液的pH值研究认为犬的精液低温保存稀释液的pH为6.5时精子有较高活力[5]。
测定方法:最简单方法是用pH试纸比色,目测即得结果,但结果误差大;比色计测定pH值结果更为准确。
2.3.2
另外,测定精清中其他化合物,如乳酸、柠檬酸、甘油磷酸胆碱、精氨酸、肉毒碱、类固醇激素和前列腺素等,有助于全面了解精液的品质和动物的生育力。
2.4
2.4.1
2.4.2
3. 精液稀释(Semen dilution)
精液稀释的目的有:扩大精液容量,增加配种数量;降低精子能量消耗,补充营养和保护物质,抑制精液中有害微生物活动,延长精子存活时间,增强受精能力;便 于精液保存和运输。因此精液的稀释,是充分体现和发挥人工授精优越性的重要技术环节。目前最普遍使用的一种稀释液是以果糖.Tris-柠檬酸为基础,添加适量的卵黄和甘油。
3.1
3.1.1
3.1.2
缓冲物质:用于保存精液适当的pH,利于精子存活。常用的有:三羟甲基氨基甲烷(Tris)、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、酒石酸钾钠、EDTA(乙二胺四乙酸)等。
防冷刺激物质:由于冷刺激,会使精子遭受冷休克而失去活力,特别是从20℃以上急剧降至0℃时。这是由于精子内的缩醛磷脂融点高,低温下容易凝结。常用的物质有:卵黄和奶类等,此类物质含有卵磷脂,卵磷脂融点低,不易冻结,进入精子体内能替代缩醛磷脂保障代谢的正常进行,同时卵磷脂能稳定精子细胞膜,防止顶体破裂。
抗冻保护剂:精液在冷冻过程中,精子内外环境的水分会形成冰晶,导致精子损伤和死亡;抗冻物质有助于减轻或消除这种危害。常用的抗冻剂有:甘油、乙二醇(EG)、丙二醇、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等。高雅等(2010)报道称,乙二醇与甘油作为保护剂的最佳浓度均为6%,但6%乙二醇对犬冷冻精液的活力高于6%甘油[7]。
抗菌物质:精液稀释液中添加一定抗菌药,有利于抑制细菌的繁殖;细菌在精液中繁殖不仅影响精液品质,而且也会造成输精后母犬生殖道的感染,甚至引起子宫蓄 脓、败血症等严重威胁生命的疾病。在采精和精液处理过程中,难免使精液受到细菌的污染,而且精液及稀释液中含有丰富的、有利于细菌繁殖的营养物质,因此, 在精液稀释液中加入抗菌药是十分必要的。常用的抗菌物质有青霉素、链霉素、氨苯磺胺等。青霉素和链霉素混合使用更具有广谱的抑菌效果;氨苯磺胺不仅可以抑 制细菌微生物的繁殖,而且可以抑制精子的代谢机能,有利于延长精子在体外的存活时间,但它在冷冻过程中对精子反而有害,所以只适用于液体精液的保存;抗生 素技术发展很快,新抗生素不断发现与合成,而且作用机制十分复杂,在精液稀释液中的使用有待进一步研究和完善。
3.1.3
酶类
激素类
维生素类
其他添加成分
3.2
4. 精液保存(semen preservation)
精液保存是为了延长精子的存活时间,维持其受精能力提高公犬配种效能。精液保存方法分液态保存和冷冻保存两大类。
4.1
4.2
精 液冷冻保存原理:精子在冷冻状态下,代谢几乎停止,生命以相对静止状态保存下来,一旦升温又能复苏恢复受精能力。从理论上讲,冷冻精液可以无限期得到有效 保存,但目前的冷冻解冻技术,只有部分精子能够正常复苏;这主要是由于在冷冻过程中,细胞内水的冰晶化对精子造成危害;冰晶化(crystallization)是指在一定降温过程中,水分子重新按几何图形排列形成冰晶(结晶体),冰晶只有在0~-60℃温度范围内形成,降温或升温速度越慢,冰晶形成越大;-15~-25℃时形成冰晶最多,故把此温区称为精子冷冻过程中的危险致死温区;冰晶先形成于精子外水分,造成精子外高渗溶液,使精子脱水损伤,同时精子内水分结晶后,体积增大和冰晶块移动,对精子产生机械损伤,也会造成精子死亡。
玻璃化(vitrification)是在超低温下,水分子保存原来无次序的排列,呈现均匀的冻结团块;精子在玻璃化冻结状态下,不会出现原生质脱水,结构受到保护,解冻后仍可恢复活力;在稀释液中添加甘油等亲水性物质,能减轻冰晶化,但甘油浓度过高对精子又毒害作用。
精液冷冻保存技术的一般步骤是:精液品质检查 → 精液稀释 → 降温与平衡 → 分装与冷冻 → 解冻与检查 → 保存与运输。
4.2.1 精液品质检查
4.2.2 精液稀释
基础液
Ⅰ液
Ⅱ液
目前精液冷冻保存应用最广泛的稀释液是卵黄-Tris稀释液(配方见下表),生产中多采用两次稀释法:首先用不含甘油的Ⅰ液对精液进行稀释,放置一定时间后加入Ⅱ液。放置时间的长短,以及此阶段是否降温,没有统一的说法。
卵黄-Tris稀释液的配方
成分 | Tris | 果糖 | 柠檬酸 | 卵黄 | 甘油 | 蒸馏水(加至) | 抗生素 |
用量 | 2.422g | 1.0g | 1.36g | 20ml | 8ml | 100ml |
青、链霉素各10万IU |
4.2.3 降温和平衡
4.2.4 分装和冷冻
张江等(2006)报道称,在Beagle犬精液冷冻研究中,冻管法效果略好于颗粒冷冻法,但是颗粒法与冻管法之间没有统计上的显著差异[11]。
禹学礼等(2004)报道在含4%甘油的卵黄-Tris冷冻稀释液中,0.5ml犬细管精液的最佳冷冻程序是[12]:
4℃ |
0℃ |
-80℃ |
-196℃ |
0.3℃/min |
垂直降温 |
30℃/min |
4.2.5 精液解冻
4.2.6 保存与运输
①
②
③
5.
5.1 输精前准备
5.1.1
5.1.2
5.1.3
5.2
5.3
5.3.1
5.3.2
5.3.3
5.3.4