研究背景： 一 研究背景： 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，hcc）是我国常见的恶性肿瘤之一， 是一个发病率高、预后极差，严重危害人类身体健康的一个疾病。乙型和丙型肝 炎病毒感染、环境因素以及遗传易感性是肝癌发生的主要背景因素。其中，乙型 肝炎病毒感染（hepatitis b virus，hbv）是肝细胞癌发生发展的一个主要危险 因素。
实验目的： 二 实验目的： 探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X 基因及其变异与原发性肝细胞 癌发生、发展的关系。
实验原理： 三 实验原理： 原发性肝细胞癌(hepatocellular carcimoma,HCC)是一种严重危害人类健康 的恶性肿瘤,其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第三位。其中大约 60%的 HCC 与 乙型肝炎病毒(HBV)感染有关。HBV 基因组 X 基因编码产生的蛋白 HBx 是一种反 式作用因子，能与细胞内多种与转录、基因调控有关的因子结合。广泛激活病毒 与细胞的启动子,参与基因调控，在 HCC 形成过程中有重要作用。本实验通过聚 合 酶 链 反 应 (PCR), 检 测 HCC 患 者 及 慢 性 乙 型 肝 炎 病 毒 携 带 者 (chronic asymptomatic carrier,CAC)患者肝组织中的 HBV X 基因,并对其常见变异位点 1 762 位及 1 764 位进行基因测序分析,进一步探讨 HBV X 基因及其变异与 HCC 发 生、发展的关系。 本实验中采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)方法,检测 22 例乙型肝炎表面抗原(hepatitis Bsurface antigen,HBsAg)阳性的 HCC 患者 及 15 例慢性乙肝病毒携带者(chronic asymptomatic carrier,CAC)患者肝组织 中 HBV X 基因,并对 PCR 产物进行基因测序,同时检测 5 例无 HBV 携带者正常肝脏 组织中 HBV X 基因。
实验材料： 四 实验材料： 1.实验标本22 例 HBsAg 阳性的 HCC 患者肝癌组织及 15 例 CAC 肝组织。其中肝癌组男 12 例,女 10 例;年龄 36~72 岁。CAC 组男 9 例,女 6 例;年龄 19~35 岁。5 例正常肝脏 组织系收集自胆囊结石伴肝活检患者(男 3 例,女 2 例;年龄 52~68 岁,血清 HBV 标志物检测结果均为阴性)。 所有标本离体后迅速放到液氮罐中快速降温,然后转 移到-80℃冰箱中保存。 2.主要试剂 蛋白酶 K，PCR 扩增试剂包括 TaqDNA 聚合酶、dNTPs、PCR 反应缓冲液 五 实验方法： 实验方法：
1.DNA 提取 采用传统的酚-氯仿-异戊醇提取法,DNA 提取后取少量于紫外线
分光光度仪测 ding DNA 纯度,剩余 DNA 置-20℃冰箱保存。 2.PCR 扩增 利用 PrimerPremier5.0 引物设计软件,设计针对 HBV X 基因序列特异的引物,HBVX 基因序列来源于 PubMed GenBank, ayr 基因型,序列号为 X 04615。5′端引物(Sense): 5′-AAC GACCGA CCT TGA GGC ATA CT-3′; 3′ 端引物(Antisense): 5′-GAC CAA TTTATG CCTACA GCCTCC-3′。PCR 扩增产 物为 115 bp。PCR 反应体系:去离子水 39μ,l PCR 反应缓冲液 5μ,l dNTPs 0. 5μ,l DNA 模板 3μ,l 上下游引物各 1μ,l TaqDNA 聚合酶 0. 5μ;l 反应条 件:95℃预变性 5min,在 95℃变性 30 s、58℃退火 30 s、72℃延伸 25 s,进 行 35 个循环,72℃延伸 10min。 3.产物测序 六 预测结果 22 例 HCC 患者癌组织及 15 例 CAC 患者肝组织中 HBV X 基因检出率均较高， HCC 患者癌组织的 HBV X 基因检出量应该高于 CAC 患者。5 例正常肝脏组织中应 该检测不到 HBV X 基因。 统计肝癌组织及携带者肝组织中 HBV X 基因发生 1 762T/1 764A 双突变率。肝癌组织中双突变率应该高于携带者肝组织，预计不会存在 1 762T 及 1 764A 单独发生突变。
结果讨论与分析：
1.一些慢性 HBV 感染进展到 HCC 的原因目前尚不清楚,宿主因素,如对 HBV 的 免疫反应、 遗传倾向、 HBV 复制率以及 HBV 基因组的变异均与 HCC 的发生有关。 高 目前,众多研究均提示 HBV X 基因及其变异与 HCC 的发生密切相关,但是关于 HBV 取 20μl PCR 反应产物测序,测序用引物为 5′端引物。X 基因与 HCC 发生关系的确切分子机制还不是很清楚。HBx 蛋白在肝癌组织中的 表达: Su 等用免疫组织化学方法研究 39 例受 HBV 感染的慢性肝病和肝癌组织, 在 16/30 例肝硬化和 10/18 例肝癌组织中存在 HBx 过表达,同时在癌前病变的局 灶性和结节性增生的肝实质细胞中也存在 HBx 过表达。人群调查发现, 85% HCC 患者的肝组织中含有特异性的 HBx 蛋白。本实验通过检测 22 例 HCC 患者癌组织 及 15 例 CAC 患者肝组织中 HBV X 基因检出率，与文献比较，观察是否存在差异。
2.HBV X 基因的点突变 HBV X 基因 1 762T/1 764A 双突变使 X 基因编码蛋白 HBx 的 130 及 131 位氨基酸分别从赖氨酸转化为甲硫氨酸(1762,A-T,AAG-ATG, K-M)及缬氨酸转化为异亮氨酸(1764, G-A, GTC-ATC, V-I)。Kuang 等和 Liu 等 [5]均发现 1 762T/1 764A 双突变与 HCC 的发生有密切的关系。Marina 等[6]研 究发现,南部非洲人中 HBV X 基因与 BCP 区重叠区域中最常发现的错义突变就是 1 762T/1 764A 双突变。这个双突变已在无症状携带者、慢性肝炎患者、暴发性 肝炎和 HCC 患者中[7]发现。并且, 1 762T/1 764A 双突变的频率在 HCC 患者中 比无症状携带者要明显升高。同样有研究发现,从慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化到 HCC 患者,随病情的变化,1 762T/1 764A 的变异率逐渐升高。这些突变在转录激 活须区(132~148 位密码子)之外,在 61 位半胱氨酸与 137 位半胱氨酸间二硫键形 成的环之内。由这些突变引起的氨基酸改变在 1 809/1 812 位核苷酸突变形成的 丝氨酸/丝氨酸存在下,进而改变 HBx 蛋白的结构而促进肝癌的形成。 本研究发现, 在 22 例 HBsAg 阳性 HCC 患者肝组织及 15 例 CAC 肝组织中,HBx 检出率相近,但是 癌组织中 1 762T/1 764A 双突变率要比携带者肝组织要高,而没有发现 1 762T 或者 1 764A 单独突变,进一步表明, 1 762 T/1 764A 双突变在 HBV 诱导的肝癌 形成中可能起重要作用。
3.HBx 蛋白的缺失突变 在相关病例的研究中,HBx 蛋白还存在相当程度的缺失突变。Hoare 等发现,在 18 例肝癌患者中有 10 例存在 HBx 蛋白的缺失突变,在 慢性 HBV 感染患者中检出率为 69%。在 HCC 发生过程中,HBV X 基因是肝细胞中最 常见的 HBV DNA 整合部分,并且从 HCC 患者中分离出来的 HBV DNA 的 X 基因绝大 多数有缺失突变。来自肿瘤组织的 HBx 蛋白的缺失突变体能够抑制野生型 HBx 蛋白抗增殖和反式激活能力,其羧基端缺失突变体能增强癌基因 ras 和 myc 的转 化能力。与全长的 HBx 蛋白相比,这些羧基端缺失的蛋白丧失了转录活性和抑制细胞增殖和转化的能力,因此截短的 HBx 蛋白反式激活功能的改变可能导致肿瘤 的发生。