病毒的超低温保存法 大多数微生物可用超低温保存， 超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。 需要复杂营 养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力( 如植物的病原性真菌) ，通常可用超 低温的方法保存(ATCC 1983;Halliday，Baker 1985) 。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞 以较慢的冷冻速率(1℃/分钟)冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～-196℃ 的液氮中。 超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油(10%) 、二甲 亚砜(5%)和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内 膜的冷冻损伤。 贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细 胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是： 将封口的小管迅速放入 37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培 养基。 超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中， 因此需要液氮罐。 在长期贮存的 过程中必须经常注意补充液氮。 这种贮存方式比冻干法需要更多的经费， 包括为了维持贮存 温度所必要的劳动力和液氮等。

    病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管(Nunc Cryoflex) ，液氮罐，防护手套和面罩， 永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。 2.3 方法 (1)剪一段两端各超出冷冻管长度 2cm 的热收缩塑料管。 (2) 将含有澄清病毒悬液 (组织培养的上清培养基， 或组织培养基内的细胞溶解产物均可) 冰浴几分钟，用灭菌移液管将 0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。 (3)将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。 (4)用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收 缩塑料管。 (5)再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。 (6)将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻(操作时要求戴面罩和手套) 。 (7)将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编 号和存放日期等。 (8)需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入 37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片 在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。

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