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超低温冷冻疗法常用的冷冻降温方法

研究表明,不同材料采用超低温冷冻法脱毒时冷冻降温方法直接关系到成苗率,选择合适的冷冻方法对脱毒成功与否至关重要。不同冷冻降温方法各有优缺点,根据材料特性选择适合的方法。目前常用的冷冻方法有:快速降温法、慢速冷冻法、逐级冷冻法、干燥冷冻法、玻璃化冷冻法、包埋玻璃化法等。直接将预培养材料投入液氮罐中的快速降温法具有操作简单、不需要特殊设备的优点,但是对含水量高的愈伤组织其成活率为零,不适用该方法。

将材料从0℃逐渐降到-100℃,使得其细胞中的含水量逐渐流出到细胞外,细胞中的含水量降到最低程度,然后再从-100℃直接投入液氮中降到-196℃,这样可以避免水分在细胞中结冰而破坏细胞,这种慢速冷冻法可以提高成活率。一般细胞在-10℃时细胞外的介质基本形成结晶,而细胞内部并未结冰,这样形成细胞内外的蒸气压差,如果使细胞在不同低温下-20,-50,-70,-100℃下各处理一段时间,使细胞内的水溶液在蒸气压下向细胞外不断扩散,脱水后细胞内原生质逐渐发生浓缩,其冰点降低,再投入液氮中时就减弱低温结冰对细胞造成的伤害,大大提高回复率和成活率,这种逐级冰冻方法在多数材料超低温保存中获得成功。对于含水量较高的愈伤组织,采用将材料进行脱水预处理,然后迅速投入液氮。这样细胞经过脱水处理后细胞内部含水量大大降低,原生质的浓度大大提高,提高愈伤组织的冷冻处理后的恢复成活率。用一种保护剂PVS2[其组成为:30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)DMSO+0.4mol/L蔗糖]对材料进行处理后再迅速投入到液氮中,细胞经过保护剂处理后可以避免细胞胞内外形成冰晶,而形成玻璃化状态,这种方法成活率高,但是很容易脱水过度,影响成活率,采取与逐级冷冻法结合处理来提高恢复率。当材料较多时,可以先采用褐藻酸钙将材料进行包埋,然后用高蔗糖浓度的培养基脱水预处理,再用干燥的硅胶进行脱水处理,再迅速投入到液氮中。为了保证成活率,经常结合几种冷冻降温方法合并使用。

 

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