研究表明，不同材料采用超低温冷冻法脱毒时冷冻降温方法直接关系到成苗率，选择合适的冷冻方法对脱毒成功与否至关重要。不同冷冻降温方法各有优缺点，根据材料特性选择适合的方法。目前常用的冷冻方法有：快速降温法、慢速冷冻法、逐级冷冻法、干燥冷冻法、玻璃化冷冻法、包埋玻璃化法等。直接将预培养材料投入液氮罐中的快速降温法具有操作简单、不需要特殊设备的优点，但是对含水量高的愈伤组织其成活率为零，不适用该方法。

将材料从0℃逐渐降到-100℃，使得其细胞中的含水量逐渐流出到细胞外，细胞中的含水量降到最低程度，然后再从-100℃直接投入液氮中降到-196℃，这样可以避免水分在细胞中结冰而破坏细胞，这种慢速冷冻法可以提高成活率。一般细胞在-10℃时细胞外的介质基本形成结晶，而细胞内部并未结冰，这样形成细胞内外的蒸气压差，如果使细胞在不同低温下-20，-50，-70，-100℃下各处理一段时间，使细胞内的水溶液在蒸气压下向细胞外不断扩散，脱水后细胞内原生质逐渐发生浓缩，其冰点降低，再投入液氮中时就减弱低温结冰对细胞造成的伤害，大大提高回复率和成活率，这种逐级冰冻方法在多数材料超低温保存中获得成功。对于含水量较高的愈伤组织，采用将材料进行脱水预处理，然后迅速投入液氮。这样细胞经过脱水处理后细胞内部含水量大大降低，原生质的浓度大大提高，提高愈伤组织的冷冻处理后的恢复成活率。用一种保护剂PVS2[其组成为：30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)DMSO+0.4mol/L蔗糖]对材料进行处理后再迅速投入到液氮中，细胞经过保护剂处理后可以避免细胞胞内外形成冰晶，而形成玻璃化状态，这种方法成活率高，但是很容易脱水过度，影响成活率，采取与逐级冷冻法结合处理来提高恢复率。当材料较多时，可以先采用褐藻酸钙将材料进行包埋，然后用高蔗糖浓度的培养基脱水预处理，再用干燥的硅胶进行脱水处理，再迅速投入到液氮中。为了保证成活率，经常结合几种冷冻降温方法合并使用。

 

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