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菌种保藏方法及注意事项

农产品贮藏时一般都采用低温贮藏法和化学药剂处理法,但是很多热带、亚热带水果,如香蕉、芒果、荔枝等在低温下容易出现冷害,不能采用低温贮藏法进行保存,并且低温贮藏成本高、耗能大、质量不稳定;化学药剂处理能够很好的实现果蔬采摘后的保鲜,但是化学试剂的残留以及有毒杀菌剂的使用,给人们带来的食品安全隐患问题,令人望而生畏。近10年来,生物保鲜成为国内外科研工作者研究的重点,利用微生物拮抗菌进行保鲜的产品已经陆续上市:Blossom-Protec;CandiFruit;Shemer;Bio-Save;MUSCODORTM等,影响微生物保鲜菌商业化生产的因素之一是:实际生产使用中,菌种的退化、在贮藏及恶劣环境中抗病能力下降。本文详细综述了微生物菌种的保藏方法,降低保鲜拮抗菌在生产、保藏过程中的变异及退化。

1传代保藏

传代保藏菌种是微生物保存中最常用的方法之一。很多微生物在低温或者干燥处理时,会很快死亡,为了保存菌种的活性,就要定期不断的进行菌种转接、培养后再保存。我们所喝的酸奶就是采用这种方式进行生产菌种保存的。这种会产生酸性物质的菌种,在进行传代培养时要在培养基中添加少量的碳酸钙。传代培养的过程中,培养的养分不要太丰富,培养温度也要比孢子最适合的生长温度略低。传代培养保存微生物的方法简单易行,只要培养皿就能实现,不需要特殊的设备,是目前实验室各类微生物保藏最常用的方法。但是此法也存在着一些缺点,如培养基容易干枯;菌种管处经常被其他杂菌污染发生霉变;菌种在反复传代的过程中发生基因突变,不能保证优良性状传递下来;在传代的过程中产生的孢子活性越来越弱。

2液体石蜡覆盖保藏

为了传代保存时,减少杂菌的侵染,使用液体石蜡进行覆盖加以辅助,就是在斜面培养基上,当在最适合的培养条件下培养出健壮的菌体后,加入已灭菌的液体石蜡油,并将此斜面培养基保藏在低温条件下。由于培养物表面覆盖液体石蜡后可隔绝空气,因此降低了微生物菌体的物质代谢,延缓细胞的衰老,同时也防止培养基水分蒸发,是一种简易的菌种保藏方法。很多产生孢子能力低的丝状菌都是采用这种方法进行保存。这种方法制作方法简单,不需要经常移种传代。对大多数种类的菌种保藏效果都比较理想。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上,没有芽孢的细菌都可以采用这种方法保藏1年左右,一些很难保藏的菌种如脑膜炎球菌,可以的采用这种方法保存至少3个月以上。但是采用石蜡覆盖保藏法的菌种携带不方便,保存时需要大量空间,以保证培养基能直立放置。在取培养物进行移种时,一般要通过火焰灼烧将石蜡融化,这个过程可能造成培养物与石蜡油飞溅,有安全隐患。

3冷冻干燥保藏

冷冻干燥保藏法为菌种保藏方法中最有效的方法之一,对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用。这种方法适用于菌种长期保存,一般可保存数年至十余年。因为冷冻干燥法使菌种处于一个无氧的真空环境中,微生物不能进行正常的新陈代谢,只能处于休眠状态。当环境变为适合生长的适合,才会继续增殖生长。所以保藏期就比较长。目前像春雷霉素、头孢霉素、卡那霉素等抗生素菌种不易产生孢子的丝状真菌,都是采用冷冻干燥法保存的。另外我国大多数生物制品菌种都是采用该法保藏。

4液氮超低温保藏

液氮超低温保藏法是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。液超低温保藏法是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓶瓶内,将该安瓶瓶放人液氮罐(-196℃)中保藏。由于菌丝体处于-196℃,其代谢降低到完全停止的状态。甘油、血清蛋白、二甲基亚砜、聚乙烯氮戊环、糊精、吐温80等可用做液氮低温保藏法的保护剂,其中甘油在进入和游出细胞时速度非常缓慢,造成强烈的脱水,从而保护细胞,是目前最常用的保护剂。不同微生物要选择不同的保护剂,再通过实验加以确定保护剂的浓度,原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度,一般甘油为10%-20%、二甲基亚砜为5%-10%、聚乙烯氮戊环为0.4mmol/L。

5蒸馏水保藏

蒸馏水保藏菌种的方法普遍的应用于医学微生物、食品微生物和工业微生物中,如皮肤癣菌、酵母、霉菌、放线菌的保藏,在食用菌金针菇的保藏中也有提到。其方法是:将菌体悬浮于蒸馏水中,即可在室温下保存数年,此法应注意避免水分的蒸发。

6结论

综上所述,传代保藏法、液体石蜡覆盖保藏、冷冻干燥保藏、液氮超低温保藏、蒸馏水保藏等菌种保藏方法都各有各的优点,针对不同的拮抗菌的特点及保藏目的需要,选择最好的保藏方法。目前,拮抗菌的保藏的最大问题是:如何保证在生产过程中菌种的稳定性,避免生产多代产品后菌种的退化及衰老,尤其是工业化生产的生物保鲜产品在货架期间的贮藏。因此,利用拮抗菌保鲜的工厂化产品的贮藏,将是生物保鲜菌保藏研究的一个重要的部分。

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