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用液氮冷冻真空保存犊牛睾丸原质细胞

犊牛睾丸细胞作为多种病毒增殖的基质,已经应用在疫苗生产中,并有广泛的开发前景,但是由于产犊季节的不均衡,给生产带来了困难,为了使生产不受季节影响,同时为了避免由保存原代细胞量大、细胞复活率低的问题,做了用液氮冷冻保存犊牛睾丸原质细胞的试验。

  1 材料与方法

  1.1犊牛睾丸 出生三天内的,未食初乳的本地黑白花公奶牛。

  1.2细胞冷冻液的配制

  冷冻液Ⅰ号:按本实验室设计的方法配制,配方略。

  冷冻液Ⅱ号:按常规方法配制,即含20%特牛血清,含5%~10%二甲基亚矾的营养液。

  1.3待冻存细胞的制备

  1.3.1原质细胞的制备:将犊牛睾丸细胞经一定方法处理后,即在原质细胞自己接加入细胞冻存液中待冻,一般一对牛犊睾丸制备的原质细胞可分装于3~5个安瓶中。

  1.3.2原代细胞的制备:按常规方法消化犊牛睾丸,制得细胞悬液,放置37℃温室培养,3~4天形成致密单层后,按常规法消化、洗涤、离心,收集细胞泥,分别加入适量的细胞冷冻液,待冻。

  1.3.3次代细胞的制备:将原代细胞按常规方法消化、培养,得次代细胞单层,再按上述方法收集细胞泥,加入适量细胞冷冻液,待冻。

  2 细胞的冷冻

  将上述加入细胞冷冻液Ⅰ号或Ⅱ号液的原质细胞、原代细胞、次原代细胞的细胞瓶,放置4℃、30分钟,再移到-50℃~-70℃冰箱中预冷2小时,然后迅速移到液氮罐中。

  3 细胞复苏

  将安瓶自液氮罐中取出,立即放入38-40℃温水中,使细胞在1分钟内融化,无菌吸出细胞悬液,加入新的生长液,将细胞稀释成50万个细胞/ml,37℃培养4小时,细胞贴壁后换液一次,继续增减形成单层细胞。

  4 结果与讨论

  实验结果如下:

  备注:

  1 每批冻存细胞冻前都有正常细胞培养对照,以确定细胞消化成功与否。

  2 冻存细胞复活率是指复苏后细胞数/冻前活细胞数比值。

  3 细胞生长情况批复苏后37℃培养4天时细胞生长的致密情况。

  4 复苏后的细胞接毒培养后,均能有效带毒,同正常培养细胞无差别。

  从上表可以看出:

  1 用冻存方法保存牛睾丸原质细胞,方法是可行的,这给应用牛睾丸细胞增值病毒的生产和试验带来了极大的方便,有利于适当安排生产,同时给器官细胞的保存提供了可靠的依据。

  2 从上表可见应用本实验室配制的细胞冻存液冻存的细胞,复苏后的存活率要比正常的细胞冻存液要高。

  3 从上表可以看出,原代、次代细胞经冻存后,复苏的存活率为零,具体原因有待于今后进一步探讨。

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