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种质资源设施保存之液氮超低温保存法

 

种质资源设施保存,是在人工控制环境下排除环境压力和破坏,有效保存种质材料的最安全的保存方式,它包括种子低温保存、超低温保存、种质离体培养保存等技术方法。

下面,液氮罐技术人员就来详细说一下种质液氮超低温保存技术。

目前正在深入研究的超低温保存方法,是长期贮藏种质的保存方法之一。这种方法是将种质材料(包括种子、组织体等)保存在-196℃的液氮环境中,以达到更长期的保持生命力或活力的目的。在液氮(-196℃)温度下,细胞的生长和代谢完全停止,能安全稳定、节省空间、长期有效地建立起离体基因库,超低温保存是长期贮存植物种质的最有效方法,甚至被认为是实现生物种质永久保存的唯一途径。

种质超低温保存方法包括将保存材料变温处理到-196℃条件下,并安全保存;在需要时将超低温保存种质的材料变温到常温条件下并恢复活力(或生命力)等一整套生物技术。

一般来说,它包括以下6个步骤:

(1)前培养:对培养体短期的生长锻炼处理,使其提高耐液氮保存的能力。

(2)防冻:培养体放入防冻液中,使其细胞降低冰点,减少因形成冰晶可能造成的损伤。

(3)变温冷冻:按照不同变温模式降温冷冻,降温速度依不同种质材料采用特定的速度。

(4)超低温保存:将冷冻材料保存到有效低温环境中,以防止冰的游移或解体。

(5)解冻:一般认为快速解冻更好。从液氮环境中取出封装好的材料,与其容器一同放入+40℃的无菌水浴中,直到解冻后才回到室温下,未封装的材料放到20~30℃的液体培养基中解冻。

(6)生命力测定:如用TTC染色法等。

种质材料的超低温保存,传统的技术有干冻法、预冻法和两步法,上世纪80年代末和90个代初玻璃化法和包埋脱水法开始应用于植物材料的超低温保存。

干冻法:利用无菌空气流、干燥硅胶或饱和溶液表面的气相等对种质材料进行脱水处理,然后快速将其投入液氮贮存。

预冻法:将种质材料在添加保护剂(如蔗糖、二甲亚砜、甘油等)后置于低温冰箱或液氮蒸汽箱(-10~-70℃)中冰冻若干小时后投入液氮贮存。

两步法:种质材料在添加保护剂后,用程序降温仪以某个速率(每分钟0.1~0.5℃)降温至转移温度(-40~-70℃),然后投入液氮中贮存,两步法较预冻法更为严格。

玻璃化法:种质材料用高浓度的复合冰冻保护剂处理后,快速投入液氮贮存,细胞直接用极高浓度的保护剂脱水,在快速降温时胞内胞外都进入玻璃化态,而不形成冰晶,从而避免了细胞结构的破坏。包埋脱水法:茎尖、分生组织和体细胞胚等种质材料用褐藻酸钙包埋后,第一阶段先在含高浓度蔗糖的培养基中脱水,第二阶段用无菌空气流或干燥硅胶脱水,然后投入液氮贮存。

超低温保存技术在保存植物花粉、种子和胚、芽、茎尖、愈伤组织和悬浮细胞等方面有应用和报道,目前主要应用在作物、果树和园林花卉种质资源保存方面,林木种质资源的超低温保存也有少量报道。

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