原生动物液氮超低温保存研究

原生动物的种类与数量很多，分布极广，生活周期短，与人类关系极其密切。反刍动物瘤胃纤毛虫类原生动物占瘤胃微生物总量的50%以上并与许多瘤胃功能有关，如纤维素、淀粉、蛋白质的消化。它们还可以降解植物和霉菌毒素，维持瘤胃内环境稳定，清除消化道中某些病原菌，增强动物免疫力从而提高肉食品的安全性[2¨。

瘤胃纤毛虫原生动物在体外很难培养，采用传统传代保种方法不仅浪费人力物力而且菌种容易丧失活性甚至死亡，实验结果的重复性差[2引。超低温保存为对纤毛虫进行体内外消化、基因组和生物

技术研究提供了方便并且可以长期保持细胞活性。

早期，研究人员采用一步慢速冷冻法保存纤毛虫成活率只有5%左右;后来人们对冷冻方法进行改进，形成两步冷冻法。第一步慢速冷冻至保温温度，使胞外水结冰;第二步保持恒温使细胞充分脱水，然后将样品直接投入到液氮中保存[2¨。

细胞的超低温保存活性与冷冻液、保护剂的种类和浓度、保护剂与细胞混合时的平衡温度和时间、冷却速度和解冻液等多个因素有关。使用甘油或二甲基亚砜作为保护剂，以25℃替代5℃作为平衡温度，纤毛虫解冻后的活性增强[23J。Nsabimana[2们研究发现不同种类纤毛虫的最佳冷却速度不同，J.prosto—ma，D.rurninantium，E.caudaturn，E.cauda—turn caudatum，P.multivesiculatum和E.maggii的最佳冷却速度分别是1.5，1.7，1.5，1.2，1.6，2.3℃/min。其它条件不变，以瘤胃液作为冻融液可显著提高纤毛虫冻融存活率。

遗憾的是，至今还未见关于使用其它超低温保存方法保存原生动物的报道。在超低温保存研究中，简单快速的检测细胞活性的方法也是非常必要的。

通过显微镜观察菌运动性确定菌活性是原生动物研究中常用的方法，但这种方法存在两个不足：一是把不运动的活细胞误认为是死细胞而导致结果不准确，二是外部环境影响细胞运动，为观察带来不便。双重荧光染色法的变异系数低，其结果的准确性更高，可作为一个快速测定原虫细胞损伤程度的工具[2扪。

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