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液氮超低温保存原理

液氮超低温保存原理

超低温冷冻保存是在液氮(一196℃)中使保存的活细胞物质代谢和生长几乎完全停止的保存方法。在这样的冷冻条件下,调节和控制细胞生长代谢的各种酶的作用受到极大抑制,细胞内部的生化反应十分缓慢,甚至停止,避免了细胞遗传性状的改变和遗传漂变。在最佳条件下活化后,细胞仍可保持其原有的代谢活性。

1.1 冷却过程中细胞受损伤的两因素假说

在低温冷冻过程中,冰晶的形成、渗透压、保护剂毒性给细胞造成多种胁迫并对细胞有一定的损害,此方面以Mazur[63建立的“双因素假说”最为著名。冷冻损伤由两个独立的因素造成:一是溶液损伤,如果冷却速度很慢,则细胞在高浓度的溶液中暴露时间过长,为达到胞内外溶液浓度平衡,水分由胞内大量流出,细胞剧烈收缩,引起细胞内原生质和细胞器的变化;二是胞内冰的形成,如果冷却速率过快,则溶液中形成大量的冰晶,浓度急速升高,但因细胞膜的渗透率有限,胞内溶液的水分子来不及渗出.造成过冷而结冰。

解冻速度过慢时,胞内冰还会发生再结晶。在冷却和解冻过程中形成的冰晶都可引起细胞体积变大或直接作用于细胞超微结构而造成致命性机械损伤。因此为了实现细胞的超低温保存需在溶剂中加入一定种类的低温保护剂,如甘油、脱脂乳、蔗糖、二甲基亚砜等,不但可以减少胞内水含量,还有保护细胞中大分子物质的作用。

1.2溶液玻璃化理论

玻璃化是指液体转变为非晶态的固化过程。它和常见的液体转变为晶体或部分结晶的固体的冻结过程不同,玻璃态固体分子之间的关系和液态无明显变化,而一般的晶体分子之间的关系和液态相差甚远。使溶液玻璃化的途径有两条:一条是增加溶液中保护剂浓度,当降温速度高于临界冷却速度时即可形成玻璃化,然而过高浓度的保护剂对细胞具有毒性作用;另一条是极大的提高冷却速率,在冷却过程中存在一个结晶高峰温度范围(240~200 K)被称作“危险温度区”,超快速冷却显著缩短了通过“危险温度区”的时间,促进玻璃化的形成。

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