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马铃薯茎尖超低温冷冻脱毒法的操作步骤

马铃薯茎尖超低温冷冻脱毒方法一般按照选择材料、切取茎尖、预培养、预处理、超低温冷冻、解冻、恢复培养、脱毒效果检测、组织培养扩繁这几个步骤来获得再生植株,经过病毒检测后,无毒植株用于生产脱毒马铃薯种薯(图2)。

 

1. 选择材料

马铃薯不同部位的组织经过超低温冷冻处理后细胞的存活力有明显差异。一般细胞体积小细胞质较浓、液泡少的分生组织细胞会比液泡大的成熟的分化细胞再生能力强、成苗率也高。研究发现选择马铃薯茎尖分生组织作为处理对象,可以提高成苗率,有利于获得脱毒苗。

2. 预培养材料

材料通过预培养使得细胞适度脱水,减少细胞内自由水含量,可以提高细胞的抗冷冻能力,从而提高成活率。目前最常用的预培养方式是在培养基中添加一些使细胞脱水的保护性物质,可以选用蔗糖、二甲基亚砜、甘露醇等。在高浓度保护性物质处理之前选用0~5℃的低温驯化,可以明显提高成活率。马铃薯茎尖可以切取2~3mm大小,然后放在0.3mol·L-1高蔗糖浓度的预培养基中预培养一天,光照16h,光照强度2000lx。高浓度的蔗糖可增加培养基的渗透压,使得马铃薯茎尖组织的细胞脱水,从而减少细胞内自由水的含量。

3. 保护剂处理

常用的抗冷冻保护剂是能够穿透细胞膜的化合物DMSO和各种糖类物质,通过促进细胞膜对水分的通透性,降低细胞内水分冰点温度,避免胞内外冰晶形成,保护细胞内的核酸、蛋白质等生物大分子物质。保护剂的选择是超低温处理成功的关键因素,好的保护剂应该满足对细胞毒性小、易溶于水、解冻后容易从细胞中清洗掉等要求。目前常用Sakai于1990年创立的按照一定配方合成的多种保护剂复合液,被称为植物材料玻璃化溶液(plant vitrification solution,PVS)。将预培养一天后的马铃薯茎尖加载到PVS2溶液中,其中PVS2液的成分为:MS+30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)二甲基亚砜(DMSO)+0.4mol·L-1蔗糖。具体方法是用移液管吸取15μL的PVS2溶液加在0.03mm厚的1.0cm×4.0cm的铝箔上,然后将预培养后的马铃薯茎尖装载到PVS2液滴中,室温25℃下处理20min,成活率可达90%。

4.液氮冷冻处理

将包裹有马铃薯茎尖的铝箔在液氮中蘸一下,然后把铝箔条放入1.5mL离心管中,再将离心管置于液氮中超低温处理1h。

5. 解冻洗涤

对超低温处理后的材料需要马上进行解冻,常用的解冻方法有两种:一是快速解冻法,适合于大多数材料,具体做法是将液氮中冷冻1小时后的材料放于25~40℃的水浴锅中进行解冻1~3min完全融化后取出材料,避免水浴温度对细胞的热伤害以及保护剂对细胞的毒害作用。另一种是慢速解冻法,适用于经过低温驯化或者经过脱水处理的材料,把液氮处理1h后的材料在0℃下慢速解冻30min左右。解冻后的材料一般都需要立刻洗涤,为了除去细胞内含的高浓度保护剂,避免对恢复培养的影响。最常用的洗涤方法是室温下用含1~2mol·L-1蔗糖浓度的培养基洗涤10min左右。在无菌超净工作台中,将液氮处理1h后的包裹马铃薯茎尖铝箔条从离心管中取出,然后迅速放入加有1.2mol·L-1蔗糖浓度的液体MS培养基中洗涤2~3次,每次10min。

6. 恢复培养

经过洗涤后的材料需要立即转移到恢复培养基上进行培养。研究发现将材料先培养在黑暗或弱光下一段时间后,再在正常光照下有利于形成再生植株。

将洗涤后的马铃薯茎尖在无菌超净工作台中取出,用无菌纸吸去残留在材料表面的洗涤培养基,接种到固体恢复培养基(MS+0.1mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3)上进行培养。培养条件选择先黑暗培养7d,再在弱光1000lx下培养7d,然后正常光照2000lx培养。当分化出根芽后转移到MS培养基上,1个月就可获得完整植株,统计成活率。

7. 病毒检测

对再生马铃薯试管苗用酶联免疫法进行病毒检测,只有不带病毒的组培苗才可以进行组织培养扩繁,用于生产无毒马铃薯种薯。

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