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精子冷冻保存技术的发展

精子冷冻保存技术的发展为珍稀、经济鱼类种质资源的保存提供了一条有效的途径,目前精子冷冻保存已经被利用到农业、畜牧、医疗、科研等生物技术相关领域,国内开始对鱼类精子进行冷冻保存研究始于上世纪80年代,到目前为止已经对30多种海淡水鱼类精子进行了冷冻保存研究,但国内在淡水水域冷水鱼类精子冷冻保存方面的研究较少,目前仅对江鳕(Lotalota)和白斑狗鱼(Esoxlucius)精子冷冻液氮罐保存技术进行了研究。

鲑鳟鱼类为国际上冷水鱼类养殖的主要品种,对于其种质资源的保存研究被广泛受到重视。Merino等利用1%BSA+40%精浆对虹鳟精子首次进行了玻璃化冷冻保存,获得了81%的成活率。研究了冷冻对虹鳟精子核DNA稳定性和后代发育的影响,有专家认为冷冻对精子质量没有造成明显的影响,外部抗冻剂可提高虹鳟精子细胞膜的稳定性。Gallant等利用不同的稀释液对大西洋鲑精子进行了冷冻保存,发现0.137mol/LNaCl、0.011mol/LKCl、0.004mol/LNa2HPO4·7H2O、7.5g/LL-α-卵磷脂和12%DMSO可以明显地降低不成活精子比率。Kusuda等认为,分别利用10%的甘油、二甲基亚砜与90%的小牛血清(FBS),10%甲醇与90%300mmol/L葡萄糖配制成混合液,适合于冷冻保存库页岛哲罗鲑(Huchoperryi)精子。

利用9种精子稀释液冷冻保存哲罗鲑精子,仅在ELS和D15中发现有成活的精子,但是成活相当低,利用ELS为稀释液,对甲醇和二甲亚砜的浓度进行调整和筛选,发现6%的甲醇冷冻精子的活力较高,而二甲基亚砜冷冻精子成活率极低。再利用D15为稀释液对其中葡萄糖浓度进行筛选,当葡萄糖浓度为30%(D30)时冷冻精子成活率较高。研究结果显示,一定浓度甲醇和葡萄糖有利于哲罗鲑精子冷冻保存,但是冷冻保存后精子活力与鲜精相比下降太多。主要原因可能与冷冻保存体积有关,利用2mL冷冻管作为精子容器,主要目的是研究哲罗鲑精子大量冷冻的技术方法,而目前报道的鲑鳟鱼精子冷冻保存大都利用250μL小体种积麦管做为冷冻精子容器,麦管贮藏体积小,保存精子量少,不利于鱼类大量精子冷冻保存与应用(Drokinetal.,1998;Merinoetal.,2012)。冷冻管体积较大,可以大量的冷冻保存,在海水鱼类精子冷冻中被广泛应用,但在冷水鱼中未有应用报导。因此对于哲罗鲑精子的大量冷冻保存还有待于对其冷冻方法做进一步的研究。

在鱼类人工繁殖和实际生产中,经常遇到养殖场技术人员将采集的大量鱼类精子直接放置在4℃冰箱,或者将精子容器放置在事先准备好的冰桶中,这样鱼类精子可以维持数小时到十多小时的活力,以这样方法来弥补和解决雌雄鱼成熟不同步的问题。但是当原精直接暴露在空气中时,由于受到环境温度、水分蒸发、氧化、蛋白质变性等多种因素的影响,使精子活力迅速降低,影响受精的效果。由于大部分养殖公司都不具备精子冷冻保存的设备和技术,所以精子的短期冷冻保存在一定程度上能够暂时解决精子的应用问题。龚丽等对二倍体和三倍体虹鳟精子短期冷冻保存进行了研究,原精液在4℃下可保持活力达5~12.5d。连晋和王拴文利用人工精浆稀释虹鳟精液并低温保存可将精子保存到60d。本研究利用4种不同稀释液(D15、D30、Stein和ELS)对哲罗鲑精子进行稀释后放置在2~4℃的保温盒中保存,精子在Stein和D30中保存时间较长,说明这两种稀释液的渗透压及溶液成份为精子的短期保存提供了较适宜的外部环境,研究结果为哲罗鲑精子的短期低温保存和应用提供了一定的技术基础。

研究发现,ELS和D30两种稀释液分别加入6%甲醇冷冻保存哲罗鲑精子具有一定的活力,30%的葡萄糖有益于提高精子活力,二甲基亚砜不适于冷冻保存哲罗鲑精子。本研究为我国珍稀冷水鱼类哲罗鲑精子冷冻保存技术及精子冷冻库的建立提供了一定的技术依据,但大量冷冻保存精子活力较低,因此哲罗鲑精子的大量冷冻保存技术还有待进一步完善。

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