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外源基因的细胞株初始培养

  293细胞比较容易转染,是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。

  293细胞的一个衍生株:293T/17的转染效率更高,成为广大研究者研究基因功能的一个强大工具。293细胞的缺陷是生长过程中贴壁强度比较小。所以在实验过程中容易流失,从而影响实验结果。如果一个实验室新得到的293细胞是邮寄得到的并且细胞在培养瓶中,就需要让细胞沉降几天时间,因为大量细胞会漂浮在培养液里。

  293细胞系是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化细胞,表达转染的腺病毒5的基因。

  来源:人体肾脏 形态:上皮细胞 生长特性:贴壁 注释:该细胞含腺病毒5 DNA 。

  培养液: MEM( 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS,1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠), 10% 马血清(热灭活)。

  传代: 吸去培养液。 用0.25% (w/) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次,以去除血清(血清会抑制胰酶的活性)。 加2-3毫升Trypsin-EDTA,放在37℃培养箱内约5分钟,直到细胞全部脱落。 加6-8毫升培养液,用移液器把细胞吹散。 加适量的细胞到新的培养器皿中。(以1:2到1:4为宜,传代期间培养液2-3天更换1次)

  冻存:95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。

  293A 比较有意思了,是293中后来又建的细胞亚株,这个A是adhere的意思,就是说293倾向于形成单层细胞(monolayer),它比293好的地方是在做计算病毒数量的空斑试验(plaque assay)293A是均匀的一层,没有细胞重叠和细胞空隙(hole),就这个意思,这个A所对的是293S(suspension).

  293T细胞表达 E1A蛋白,S40大T抗原,含有S40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。

  293FT细胞能制造高滴度的慢病毒。293A细胞来源于人肾纤维母细胞,组成性表达 E1A 和 E1B 蛋白。

  QBI-293A细胞培养

  293A 细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆,具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感,当细胞超过70%汇合时,一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下,QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293作为第一代,则30代内能得到最佳结果。一旦到了30代,最好复苏一管细胞开始新的培养。所以,我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的QBI-293A细胞库。

     5.1.1 QBI-293A细胞初始培养

  1. 将冻存的一管QBI-293A细胞在37℃水浴轻轻晃动融化。

  2. 融化后在超净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。

  3. 将细胞转入15mL无菌离心管中,加入10mL DMEM 10%,600×g离心5分钟使细胞沉淀。

  4. 弃去上清。

  5. 将细胞用10mL DMEM 10%重悬,轻轻打匀

  6. 转入75cm2培养瓶或100mm培养皿中培养。

  7. 在5% CO2孵箱中37℃培养过夜。

  8. 第二天观察细胞汇合率,若合适则可进行实验,否则按5.1.2所述继续培养。

  5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖

  QBI-293A细胞必须按1:10到1:20传代

  1. 室温下胰酶消化1~3分钟使贴壁细胞脱落

  2. 拍打培养瓶边缘使细胞脱落,在倒置显微镜下观察细胞是否变圆,是否已从培养瓶表面脱落。

  3. 按需要用新鲜培养液稀释细胞悬液,转入新的培养瓶中。在5% FBS中,细胞倍增的时间是26小时,在10% FBS中稍短一些。

  5.1.3 QBI-293A细胞的冻存

  建立细胞库时必须使培养的细胞汇合率低于50%,以保证亚克隆的特定表型。

  1. QBI-293A细胞必须在含10%高质量FBS的DMEM中培养。

  2. 将健康生长的QBI-293A细胞离心沉淀。

  3. 以最小体积的DMEM 10%重悬细胞。

  4. 用血球计数器进行细胞计数。

  5. 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重悬细胞,细胞终浓度为1×106/mL。

  6. 无菌操作将1mL细胞悬液转入2mL冻存管中。

  7. 将冻存管放入冻存盒中,-80℃储存24小时。这一简便措施可保持约1℃/分钟的降温速率,适于冻存细胞。

  8. 第二天将冻存的细胞转入液氮罐或-150℃冰箱中长期保存。QBI-293A细胞若正确冻存,则可在液氮罐中保存数年。

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