淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

　　1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

　　一、细胞融合前准备

　　(一)　免疫方案

　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

　　1.　颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

　　初次免疫　　　　　　　1×107/0.5ml ip (腹腔内注射)

　　↓　2～3周后

　　第二次免疫　　　　　　1×107/0.5ml ip

　　↓　3周后

　　加强免疫(融合前三天)　1×107/0.5ml ip或iv(静脉内注射)

　　↓

　　取脾融合

　　2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　│　　　　　(一般0.8～1ml　0.2ml/点)

　　↓3周后

　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　│　　　　　　　(ip剂量不宜超过0.5ml)

　　↓3周后

　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip

　　│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)

　　↓2～3周后

　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

　　(二)　饲养细胞

　　在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备

　　小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6～10周龄

　　↓

　　拉颈处死　浸泡于75%酒精，消毒3～5分钟

　　↓

　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　↓

　　用无菌注射器注入6～8ml培养液

　　↓

　　反复冲洗，吸出冲洗液

　　↓

　　放入10ml离心管，1200转/分离心5～6分钟

　　↓

　　用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37℃　CO2孵箱培养

　　一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106/ml，小鼠脾细胞为1×106/ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105/ml，均为100μl/孔。

　　(三)　骨髓瘤细胞

　　骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量　McAb。

　　常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。

　　骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20%，细胞的最大密度不得超106/ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

　　一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。

　　保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。

　　(四)　免疫脾细胞

　　免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

　　脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×108左右。

　　二、细胞融合，选择杂交瘤

　　(一)　细胞融合流程

　　(1)　取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

　　(2)　同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

　　(3)　将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

　　(4)　弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

　　(5)　轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

　　(6)　在室温下融合:

　　①　30秒内加入预热的1ml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMSO，边加边搅拌。

　　②　作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

　　③　加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

　　(7)　离心，800rpm，6分钟。

　　(8)　弃上清，先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

　　(9)　根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

　　(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5%CO2孵箱培养。

　　一般一块96孔板含有1×107脾细胞。

　　(二)　HAT选择杂交瘤

　　应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

　　一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20%小牛血清完全培养液中。

　　因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl/孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择，可得到满意的筛选结果。

　　50×HAT

　　H:　5×10-3M

　　A:　2×10-5M

　　T:　8×10-4M

　　一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

　　三、抗体的检测

　　筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

　　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

　　常用的方法有:

　　1.　ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。

　　2.　RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。

　　3.　FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。

　　4.　IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

　　上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

　　可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

　　四、杂交瘤的克隆化和冻存

　　克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

　　(一)　克隆化方案

　　用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

　　1.　有限稀释法的程序

　　①　制备饲养细胞悬液(同融合前准备)

　　②　阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×103/ml

　　③　取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml 含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

　　④　培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。

　　⑤　第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。

　　注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

　　2.　软琼脂法

　　①　软琼脂的配制

　　含20%FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640

　　1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

　　0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

　　②　用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

　　③　按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

　　④　1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

　　⑤　混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5%CO2孵箱中。

　　⑥　4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。

　　⑦　检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。

　　(二)　杂交瘤细胞的冻存

　　及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。

　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。

　　细胞冻存液:

　　50%小牛血清

　　40%不完全培养液

　　10%　DMSO(二甲亚砜)

　　冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至 0℃ 后放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

　　五、单克隆抗体的大量生产

　　大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

　　1.　体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg/ml，如果大量生产，费用较高。

　　2.　体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

　　①　实体瘤法　对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml, 共2～4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg/ml。但采血量有限。

　　②　腹水的制备　常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

　　六、单克隆抗体的鉴定

　　对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:

　　1.　抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如① 制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②　制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

　　2.　McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3%)，将有利于沉淀线的形成。

　　3.　McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

　　4.　McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

　　5.　McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。

　　七、影响因素、失败原因分析

　　由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其主要失败原因和影响因素有:

　　1.　污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。

　　2.　融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。

　　3.　杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

　　①　融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。

　　②　有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

　　③　对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。

　　三要:

　　要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

　　要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

　　要定期进行再克隆。

　　三不要:

　　不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。

　　不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

　　4.　杂交瘤细胞难以克隆化

　　可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

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