生物实验室利用液氮罐进行大鼠肝S9的制备和蛋白含量的精确测定
1 实验目的
学会大鼠肝S9的制备及其蛋白含量的测定。
2 实验材料与方法
2.1实验动物
大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周 龄，150g左右
2.2试剂
1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、多氯联苯、β-萘黄酮
Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约800ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml
2.3器材
低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等
2.4 实验操作
2.4.1试剂的配制
（1）Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml
（2）考马斯亮兰G-250染料：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1升，滤纸过滤。
2.4.2肝S9的制备
（1）诱导 苯巴比妥钠80mg/kg， 腹腔注射，连续3～5d，最后一次给药后24h后采样。
（2）采样 采样前禁食24h，但可以自由饮水；断头处死；无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。
（3）肝匀浆的制备 弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 Tris-HCl缓冲液溶液 3mL/g （肝湿重），转入冰浴，用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器匀浆。
（4）制备S9 将肝匀浆于低温高速离心机0～4℃ 000g 离心 10min上清液即为S9。
（5）分装保存 将制备好的S9于无菌冷冻管或安瓿中保存，每个安瓿2mL左右。于液氮罐速冻后置-80℃低温保存。深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。
2.5蛋白含量测定（考马斯亮兰染色法）
2.5.1测定原理
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料在595nm下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。
2.5.2特点
（1）灵敏度高，比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达0.5 mg
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
2.5.3试剂与器材
试剂：
标准蛋白质溶液：1mg/ml牛血清清蛋白（BSA）
考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1升，滤纸过滤。
Tris-HCl缓冲液： 6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml（0.05M）
2.5.4操作方法
微量法制定标准曲线
按下表加样，混匀，室温静置5-10min，以0号试管为空白对照，于595nm处比色测定吸光度，平行测定三次。95nm处吸光度为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
表一：测定标准曲线的试样
样品编号 0 1 2 3 4 5 6
标准血清溶液（ug）
标准血清溶液（ml）
蒸馏水（ml） 0
0
0.1 10
0.01
0.09 20
0.02
0.08 40
0.04
0.06 60
0.06
0.04 80
0.08
0.02 90
0.1
0
考马斯亮兰试剂（ml） 5.0
肝S9蛋白质浓度的测定
测定方法同上，分别取肝S9组分10倍稀释液20mL、30mL、40mL，按下表加样，测595nm的吸光度值，平行测定三次。根据所测定的平均值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
表二：待测蛋白的试样
样品编号 0 1 2 3
上清液（ml）
蒸馏水（ml） 0
0.1 0.02
0.08 0.03
0.07 0.04
0.06
考马斯亮兰试剂（ml） 5.0
3 实验结果
表三：准曲线管的吸光度值
试样 1 2 3 4 5 6
一 0.012 0.087 0.209 0.330 0.465 0.630
二 0.062 0.084 0.245 0.360 0.472 0.600
三 0.085 0.100 0.258 0.380 0.445 0.620
平均值 0.053 0.090 0.237 0.357 0.461 0.617
图一：蛋白质浓度和吸光度的标准曲线图
表四： 稀释液样品吸光度值
试样 1 2 3
一 0.255 0.439 0.520
二 0.208 0.280 0.466
三 0.195 0.435 0.690
平均值 0.220 0.385 0.559
利用软件读出稀释液样品的蛋白分别为0.038、0.066、0.095。
算出三次取样的上清液浓度分别为19 mg/ml、22 mg/ml、24 mg/ml，取平均值得蛋白质的浓度为21.7 mg/ml。
4讨论
肝脏微粒体中含有多种酶系统,是许多药物、杀虫剂、除草剂、污染物及食物添加剂等外源性高脂溶性物质在体内的主要生物转化场所,也称为肝微粒体药物代谢酶,简称为肝药酶。该酶系统底物面广,活性个体差异大,影响活性因素多。其中最重要的是混合功能氧化酶系统,可催化许多不同型的氧化反应,如羟基化,烷基化,脱氨基化,脱卤素,硫原子氧化等。该酶系统中一个主要成分是细胞色素P450,是由与一氧化碳结合后,在光谱450nm处有吸收峰而得名。细胞色素P450含量高低反映了混合功能氧化酶系统活性的高低,这个系统将分子氧中一个氧原子氧化药物,另一个氧原子生成水,没有产生相应的还原物,故也称为细胞色素单加氧酶。肝S9主要存在于肝细胞内质网中，是一个酶系统。
肝微粒体酶的制备需在无菌条件下操作，制备之后要用液氮速冻后置-80℃低温保存。冻干法是生物化学、生物制剂和微生学用以保持某些蛋白质、酶类和原核生物活性的较好方法之一。保持肝的代谢活性, 实质上就是要保持肝内微粒体膜上的酶类的活性。因此, 用冻干法保持肝的代谢活性。本次实验过程肝S9制备好以后直接用于测定因此没有进行冻干储存的步骤。
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