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液氮超低温冻结法详细操作步骤

液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮,或在-150℃的氮气中的长期保藏方法,它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。

操作步骤如下:

1、安瓿管或冻存管的准备

用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管,或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净, 121℃下高压灭菌15-20分钟,备用。

2、保护剂的准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时,应注意其浓度,一般采用10-20%甘油。

3、微生物保藏物的准备

微生物不同的生理状态对存活率有影响,一般使用静止期或成熟期培养物。

分装时注意应在无菌条件下操作。

菌种的准备可采用下列几种方法: 刮取培养物斜面上的孢子或菌体,与保护剂混匀后加入冻存管内;

接种液体培养基,振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内;

将培养物在平皿培养,形成菌落后,用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块(直径约5-10毫米),真菌最好取菌落边缘的菌块,与保护剂混匀后加入冻存管内;

在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基,接种菌种,培养2-10天后,加入保护剂,待保藏。

4、预冻

预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃为好、使样品冻结到-35℃。

目前常用的有三种控温方法:

—— 程序控温降温法,应用电子计算机程序控制降温装置,可以稳定连续降温,能很好地控制降温速率。

—— 分段降温法:将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却,或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温,将安瓿管或塑料小管,先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小时,然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5℃。

—— 对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。

5、保藏

将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150℃,液相中温度为-196℃。

6、复苏方法

从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管,应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止,一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管,将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

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