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液氮保存胚胎脑组织与移植的实验研究

  本实验观察了大鼠胎脑组织在液氮中保存的细胞存活率,并用保存的组织和新鲜组织做同种异体移植实验。

  一、实验方法

  正常妊娠15~21天的SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后,在无菌条件下剖腹取胎,切取所需胎脑组织,制成1mm大小的组织块。用吸管将其移入含10%二甲基亚砜(DMSO)的无血清DMEM培养液中,装进冻存管,于4℃平衡1小时后置入-30℃冰箱。约1小时后标本温度降至-30℃(降温速率为0.5℃~1.0℃/分),然后放入液氮中保存。需要时,取出冻存管于37℃水浴中复温,冰块熔化后再用Hank液以1∶1比例对冻存液反复稀释4次,每次3分钟。此时即可用于检测和移植。细胞存活率检测先采用胰酶消化制成细胞悬液,用0.4%台盼蓝染色1分钟,再按血球计数方法对死活细胞分别计数,求出细胞存活率。脑内组织移植分A、B两组进行,每组12只,分别进行新鲜组织移植和保存组织移植。两种组织均取自胎鼠顶叶,前者离开母体时间不超过20分钟,后者在液氮中保存30天。采用左顶叶皮层切开移植,每次植入3~5块组织。饲养6~8周后处杀,取脑,连续石蜡切片,进行HE、Nissl和嗜银染色。

  二、结果

  细胞存活率观察:不同部位组织在液氮中保存10天和30天,细胞存活率(%)大脑组织为67.78±4.46和65.14±4.55,小脑组织为68.93±5.67,脑干组织为71.07±7.43和69.63±1.99。经方差分析,三种组织之间细胞存活率差别不显著(P>0.05),不同保存时间之间细胞存活率差别也不显著(P>0.05)。

  脑内移植组织学观察:A组移植物成活例数7/12,移植物位于皮层下或伸入侧脑室,体积较大,周边有薄层胶质细胞反应带。移植物内是均匀分布的大型神经元和少量散在的胶质细胞。神经元核大,染色淡,核仁清楚,并可见到双核仁细胞,胞浆中尼氏小体丰富。移植物内有新生血管结构及比较致密的神经纤维网,在交界面上也有少量神经纤维。B组移植物成活例数2/10(2例感染不计),移植物位于皮层下,体积小,呈散在的细胞团样,神经元核大淡染,胞浆不丰富。移植物内也可见到血管内皮细胞,嗜银染色见移植物中神经纤维稀少。

  三、讨论

  本实验考察了两步法梯度降温液氮保存胎脑组织的可能性。此法保存大鼠胎脑组织10天和30天平均细胞存活率在60%~70%。将新鲜的和保存30天的组织植入同种大鼠脑内,组织学检查发现两组都有移植物成活,但是与新鲜组织移植相比,保存的组织移植后移植物体积小,神经元数量少,胞浆不丰富,移植物内神经纤维少见,表明神经元分化较差。结果提示,用两步法梯度降温液氮保存胎脑组织可取得较高的细胞存活率,移植后也有一定的成活率,但是移植物成活质量明显不如新鲜组织移植。所以,这种保存方法能否实际应用还值得讨论和进一步研究。

 

 

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